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咸姐
#肿瘤免疫治疗#
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在复发性和难治性B细胞恶性肿瘤中表现出前所未有的治疗活性，然而，随之而来的是不容忽视的普遍甚至可能致命的副作用，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性。此外，CAR-T疗法在实体瘤中的疗效却一般，部分原因在于缺乏肿瘤特异性细胞表面抗原，同时，候选实体瘤靶点在重要的正常组织上的共同表达也增加了靶向非肿瘤毒性。
目前已有多种策略用于增强CAR-T细胞对实体瘤的效力，包括增加对抗原的敏感性、诱导衰竭抗性、破坏抑制基因以及提供放大T细胞扩增或持久性的信号等。然而，这些方法在增强抗肿瘤反应的同时，也增加了毒性风险。现阶段已有两种类型的CAR-T细胞平台，一种是组成型CAR-T细胞平台，但是，由于CAR-T细胞是自我扩增并且在扩增和活性方面表现出患者间的高度变异性，因此其控制毒性发作后这些有效的免疫效应物的剂量和活性的能力有限；另一种是可药物调节的CAR平台，可以通过小分子药物远程控制CAR-T细胞的活性，为控制CAR-T功能提供了潜在的有吸引力的安全特性，而且无需永久消融细胞。而且这样的平台还允许调整CAR-T细胞的活性以避免毒性。然而目前已报道的药物调控系统受到了不少限制，如动态范围不良、关闭状态下残留的“泄露”活性、细胞表面CAR的表达降低、免疫抑制药物的使用、以及与组成性CAR相比药效差等。毫无疑问，兼具安全与疗效的新一代CAR系统成为刻不容缓的课题。
年4月27日，来自美国斯坦福大学的CrystalL.Mackall团队在Cell上在线发表题为Enhancedsafetyandefficacyofprotease-regulatedCAR-Tcellreceptors的文章，报道了一种利用由FDA批准的小分子药物调节的高性能药物可调节系统——由可抑制蛋白酶进行的信号中和（SNIP）——的设计和开发，证实SNIPCAR-T细胞平台提供了可靠的安全开关，降低了CAR-T细胞的靶向非肿瘤毒性，并且没有“泄露”活性，同时其在多种原位实体瘤模型中的疗效均优于组成型CAR-T细胞平台。
本研究力求开发一种可由FDA批准的小分子调控的高性能CAR平台。基于丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白酶（NS3p）和蛋白酶抑制剂调控多种蛋白的良好结果，通过多次在不同CAR功能域之间共表达NS3p和一个NS3p切割位点（CS）的尝试，研究人员最终构建了匹配的CD8α跨膜结构域（8/8Tm）的反式SNIP系统，利用小鼠体内模型优化CS，实现了在基础状态时可切割CAR使其处于失活状态（OFF状态），而当暴露于NS3p抑制剂grazoprevir(GPV)后则会阻止其切割而保留功能性CAR（ON状态）。通过体内和体外模型证实该系统在OFF状态下未显示出可检测到的“泄露”活性，而在ON状态下的抗肿瘤活性则最强（图1）。同时，该SNIP系统中膜结合蛋白酶的表达不影响CAR表达，其具有广泛的动态控制范围和不受干扰的表面表达。值得一提的是，使用反式SNIP架构，通过交换单链可变片段（scFv）结构域来生成针对其他肿瘤抗原的SNIPCAR，研究人员发现所有4-1BB共刺激的SNIPCAR均采用8/8配置，所有CD28共刺激的SNIPCAR均采用28/28（匹配的CD28Tm结构域）配置。
图1
随后，研究人员比较了上述优化了的SNIPCAR与组成型CAR在各种原位实体瘤小鼠模型中的功效。对接种了不同肿瘤细胞（包括神经母细胞瘤、骨肉瘤等）的NSG小鼠进行SNIP或组成型CAR-T细胞治疗，结果显示与组成型CAR-T细胞相比，On状态下的SNIPCAR-T细胞的抗肿瘤功效明显增强，肿瘤清除速度更快。更有甚者，对于难治性中枢神经（CNS）肿瘤如成神经管细胞瘤，SNIPCAR-T细胞的疗效也明显优于组成型CAR-T细胞。使用Antares生物发光报告基因进行T细胞成像发现，SNIPONCAR-T细胞在CNS和外围的持久性更强。此外，脾脏中SNIPCAR-T细胞的功能增强、干细胞记忆亚群增加。与此同时，在T细胞输注10天后，用从大脑和脾脏提取的CAR-T细胞进行体外刺激，发现脑浸润SNIPCAR-T细胞的激活程度更高，而组成型CAR-T细胞激活的基础水平增加，对抗原刺激的反应有限，且衰竭标志物CD39水平升高。
进一步地通过质谱流式技术、大体积RNA测序、单细胞测序分析，研究人员发现在表型和转录水平，SNIPCAR-T细胞与组成型CAR-T细胞有很大的不同。SNIPCAR-T细胞在过继转移前表现出衰竭特征的减弱，而在过继转移后表现出扩增的更强，同时在体内产生干细胞样群和效应子亚群，从而显着增强对抗实体瘤的效力。深入的表型、信号和功能数据表明，SNIP系统中信号结构域的切割破坏了CAR主导信号，从而导致在OFF状态下T细胞衰竭水平的降低以及更强的干性。当静止的SNIPCAR-T细胞在有限的时间内被GPV激活时，它们比传统的CAR-T细胞乃至始终处于ON状态的SNIPCAR-T细胞都具有更大的能力将CAR近端信号转导到下游通路，并有更快的肿瘤杀伤动力学。
那么，SNIP系统是否可以在CAR介导的靶向毒性事件中提供安全开关呢？答案是肯定的。研究人员构建了可致命的靶向非肿瘤ROR1CAR毒性小鼠模型，结果显示，SNIP不仅明显优于组成型CAR系统，也优于其他药物可调节的CAR系统，对于SNIP系统而言，停止给药可逆转毒性，而且调整给药可为SNIPROR1CAR-T细胞打开治疗窗口。
综上所述，本研究开发了SNIP——一种优化的、基于蛋白酶的、药物调节的平台，利用FDA批准的小分子实现了远程控制和不干扰CAR功能的通用分子结构，同时在十种不同的小鼠模型中证明了SNIP的有效性和安全性，包括四种针对三种不同抗原的原位实体瘤模型，并且与组成型CAR相比，该平台显示出更强的效力，且经过设计，完全没有“泄漏”活性（图2），由此为临床转化实现提高CAR-T疗法的安全性、有效性和更广泛的传播提供了重要的基础。
图2
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