特别综述
本文是香港中文大学于君教授发表在NatureReviewsGastroenterologyHepatology上题为Organoidmodelsofgastrointestinalcancersinbasicandtranslationalresearch的重磅观点综述。癌症是世界范围内的主要公共卫生问题。胃肠道癌症约占全球癌症发病率和死亡率的三分之一。从历史上看，肠粘膜中肿瘤起始和发展的机制已经通过体外癌细胞系和动物模型进行了研究。传统的细胞培养方法与大量的异常基因组变异有关，这些异常基因组变异不再反映原始肿瘤的(转移性)行为或对治疗的反应。类器官技术已成为培养胃肠道肿瘤和相应正常组织的一种强有力的替代方法，保留了它们的遗传、表型和行为特征。重要的是，越来越多的证据表明，类器官培养在预测个别患者的治疗结果方面有很大的价值。在此，我们回顾了最常见的胃肠道肿瘤，包括大肠癌、胃癌、食管癌、肝癌和胰腺癌的类器官模型的最新文献，以及它们在模拟肿瘤起始、转移进展和治疗反应方面的价值。我们还探讨了当前类器官模型的局限性，并讨论了如何改进这些模型，以最大限度地促进未来的基础研究和转化研究，特别是在药物发现和个体化医学领域。
Keypoints核心观点
胃肠道癌占全球癌症发病率和死亡率的三分之一，因此，必须通过提高疗法将基础研究的知识转化为对健康的益处。
临床前的癌症研究严重依赖细胞系和动物模型，但两者都无法重现最初的人类肿瘤。
类器官技术已成为培养胃肠道肿瘤及其相应正常组织的一种强有力的替代方法，保留了它们的遗传、表型和行为特征。
类器官模型已被用于模拟肿瘤的起始、转移进展和最常见的胃肠道癌症的治疗反应，包括大肠癌和肝癌。
来自患者的类器官的临床应用是有希望的，因为积累的证据已经揭示了潜在的类器官模型在药物发现，模拟治疗反应和个体化医学。
目前的类器官模型具有多重局限性，因此，需要做更多的工作才能使它们最大限度地有益于胃肠道癌症的基础研究和转化研究。
癌症是一个主要的公共卫生问题，也是全球死亡的主要原因，年全球约有万新增病例和万死亡病例(参考文献1)。全球大约三分之一的癌症发病率和死亡率与胃肠癌有关。改进的全身治疗方案使转移性胃肠道癌患者的无病生存期延长至2年以上，但对长期总生存率影响不大。此外，还缺乏早期发现癌前病变和准确预测晚期胃肠道癌患者预后的工具。年，美国三种最常见的胃肠道癌症ー结直肠癌、胃癌和肝癌ー患者的5年生存率分别为65%、31%和18%(参考文献2)。因此，有必要通过推进癌症治疗学，将胃肠道癌症的发生和发展的知识转化为对健康的益处。
癌细胞系已被广泛用作体外疾病模型来研究癌症生物学。癌细胞系易于在培养基中建立和维持，可以通过各种技术进行基因改造，如Crispr-Cas9基因组编辑和同源重组敲除特定基因。这项研究极大地促进了特定信号通路在癌症生物学各个方面的作用的机制研究，包括转移、药物反应和耐药性。此外，癌细胞系可以很容易地用于药物发现的高通量筛选。然而，许多基于细胞系的药物发现程序5,6的高失败率至少部分可能是由于癌细胞系对原始肿瘤的多种特征表现不佳。这些特征包括肿瘤的基因组成、瘤内基因的异质性以及缺乏相关的基质元素，包括构成体内肿瘤微环境的基质细胞类型和细胞外间质分子(ecm)。值得注意的是，年发表的一项研究比较了两个实验室培养的个人类癌细胞系(包括乳腺癌、黑色素瘤、肺癌和肝癌)的全基因组测序数据，结果显示，已建立的2D癌细胞系实际上具有高度遗传异质性。数据表明，异质性是由于癌细胞系原先存在的亚克隆数量的变化和新的遗传变异的出现。这种变化可能导致基因表达模式改变和遗传不稳定，从而影响药物敏感性。
类器官技术是在深入研究肠道干细胞(ISC)自我更新、增殖和分化信号的基础上发展起来的，它可以使小鼠Lgr5表达的ISC长期扩增为自我更新的隐窝绒毛结构，称为“迷你肠道”8。从那时起，这个方案的组织特异性适应性使得建立类器官模型成为可能，这些模型不仅来自肠粘膜的不同器官，如小肠、结肠、胃、食道、肝脏和胰腺(表1)，还来自脑9、10、肺11、12、前列腺13、14、视*醇15、16、唾液腺17、18、乳腺19和味觉20(参见文献21)。
到目前为止，还没有一致的“类器官”的定义。一般来说，类器官是由多种器官特有的细胞类型组成的三维培养物，这些细胞能够概括结构和基因表达谱，以及它们相应器官的一些关键特征和功能。大多数类器官系统是由器官受限的成体干细胞或人类多能干细胞(HPSCs)产生的。重要的是，间充质组织室可在HPSC衍生的器官样细胞22-25中产生，而器官或组织干细胞产生的类器官样细胞大多缺乏间充质或其他基质和免疫细胞类型21。在过去的十年中，类器官已被用于模拟各种人类疾病，并建立了不同的类器官培养方法，包括广泛应用的表皮生长因子(EGF)、Noggin和R-spondin-1(以下简称ENR)培养和气液界面培养。这些新颖的类器官模型已应用于多个研究领域，例如组织自我更新或修复研究、疾病模型、治疗研究、药物发现和个体化医学(图1)，
以及器官形成和发育过程可以用HPSC衍生的类器官来模拟。特别是，在癌症研究方面已经作出了巨大的努力，例如使用肿瘤衍生的类器官作为人类癌症(包括胃肠道癌症)的体外模型(表2)。
本文综述了已建立的肠道、胃、食道、肝脏和胰腺等不同器官的类肠粘膜器官模型及其相关癌症。我们也回顾了胃肠道肿瘤发生、发展和转移的类器官研究的重要发现。此外，我们还讨论了胃肠道类器官癌模型如何有益于肿瘤学的基础研究和转化研究，特别是在药物发现和个体化医学领域。
Intestinalorganoids肠道类器官
“迷你肠”小肠类器官是在事先确定Lgr5作为ISCs标记物和负责调节肠道干细胞功能的基本信号通路的基础上发展起来的。在这个系统中，分离的肠上皮细胞被植入一个富含层粘连蛋白和IV型胶原的基质中，称为基质凝胶(BD生物科学)，作为基底膜支持上皮(肿瘤)细胞的体外替代物，同时补充特定的生长因子组合，以模拟体内隐窝基底的微环境(图1)。简言之，小肠类器官培养必须补充R-spondin-1(Wnt信号和Lgr5配体的增强子)、EGF(一种有丝分裂原)和Noggin(一种骨塑型蛋白信号抑制剂)，而Wnt3a则是结肠类器官培养必不可少的因素。添加烟酰胺和Rho激酶、Alk和丝裂原激活蛋白激酶P38抑制剂对人小肠和结肠类器官的长期扩张是必不可少的，而撤除Wnt3a、烟酰胺和p38抑制剂则使结肠类器官能够沿着所有肠上皮细胞分化。
类器官也可以从HPSCs中衍生出来，作为组织发育的模型。年spence等人。激活素处理的HPSCs在含4(FGF4)和Wnt3a的培养基中孵育，然后在基质中加微肠培养基中进一步培养，生成具有极化柱状上皮细胞22的类绒毛样细胞。这些类器官由隐窝样增殖区组成，表达ISC标记，能分化为肠上皮的所有细胞类型，包括肠上皮细胞、肠内分泌细胞、Paneth细胞和杯状细胞。通过各种方法成功建立了类器官系统之后，科学家们开始使用这种强大的技术来模拟人类癌症，包括胃肠道癌症。
Organoidmodelsofcolorectalcancer大肠癌的类器官模型
结直肠癌(CRC)是世界上第四大最常见的癌症，也是第三大最常见的癌症死亡原因1。CRC是一种异质性疾病，涉及一系列基因组和表观遗传改变29-31。大多数CRCS遵循两个形态学多步骤途径:腺瘤-癌序列(所谓的常规途径，占所有结直肠癌病例的60%)和锯齿状瘤变途径(占所有结直肠癌病例的35%)。Lynch综合征，占所有结直肠癌病例的5%，是遗传性的，通过锯齿状病变29-31偶尔发生。值得注意的是，虽然锯齿形态可以检测到腺瘤，它通常是丢失在癌症，因此不适合分类不同的CRCs的基础上的形态。
对结直肠癌基因组和表观基因组图景的更好理解现在使结直肠癌分类的模式更加准确32。年，癌症基因组图谱(TCGA)联盟对例大肠癌病例进行了全面的鉴定，分析了外显子序列、DNA拷贝数、启动子甲基化以及mRNA和microRNA的表达33。本研究中的病例根据其突变率被分为两个亚型。突变率8.24/个细胞(占全部检查病例的84%)为未过突变的大肠癌，突变率12/个/个细胞的肿瘤(占全部检查病例的16%)为过突变的大肠癌。
年，人们提出了大肠癌的共识分子亚型(CMS)分类，其中CMS1-CMS4亚型是根据基因表达的重复模式定义的。CMS1亚型主要由具有高水平微卫星不稳定性(MSI)和反映促进免疫细胞涌入的表达模式的肿瘤组成。CMS2代表WNT活性较高的典型亚型。CMS3的特征是代谢信号通路的异常激活。最后，间充质亚型CMS4的特点是间质含量高，预后差33，34。
最初建立的用来培养小鼠小肠的有机体方案被修改成能够培养人类结直肠癌组织27。有趣的是，补充Wnt3a或R-Respondin-1不是人类CRC类有机物长期传代所必需的，而且人类CRC类有机物的生长通常比来自非癌症结肠细胞的有机物更成功，具有更高的类器官形成效率和更快的增殖速度27。这一观察结果表明，CRC类有机物具有内源性WNT途径激活作用。此外，还建立了来自患者(也称为活生物库)的代表该疾病的多个有机类培养物集合，并确定了其特征为35，36。结直肠癌类有机物不仅可以从肿瘤切除标本中产生，也可以从常规的临床活检中以非常高的效率产生37。最后，利用CRISPR-CAS9技术对正常组织器官进行基因修饰，可用于研究大肠癌的发生和发展(38-40)。
ConventionalCRC
要将正常结肠上皮转化为侵袭性和转移性结直肠癌，染色体不稳定(CIN)途径中的多个突变是必需的。腺瘤-癌序列模型认为，体细胞中特定基因改变的顺序获得与CRC41的进展有关。首先，APC功能的丧失启动了WNT信号，导致良性息肉的形成。KRAS、Smad4和TP53等基因的后续突变通过失调对细胞周期调节和细胞增殖至关重要的多条细胞通路，诱导良性息肉转变为侵袭性和转移性表型42。全基因组分析表明，大多数基因突变(94%)属于五种致癌途径之一：Wnt、转化生长因子-β(转化生长因子-β)、磷酸肌醇3-激酶、Ras-MAPK和p53(参考文献33)。
Crispr-cas9基因组编辑系统已在多项研究中应用于类器官。Drostetal.利用Crispr-cas9将3个肿瘤抑制基因(Apc、Smad4和TP53)和一个癌基因(Krasg12d)引入人结肠组织中。不像类器官来源于健康的人结肠组织，这些突变的类器官有能力生长在缺乏一些生态位因子，如Wnt3a，R-spondin-1和EGF。为了建立腺瘤-癌序列的类器官模型，根据每个突变对“迷你肠”培养基中的组分组合进行改变:在APC基因敲除的类器官中去除Wnt3a和R-spondin-1，在Krasg12d基因组中去除EGF，在Smad4-/-类器官中去除noggin。在matano等人的一项研究中，类似的方法被应用于来自正常人类肠道上皮的类器官，他们在上述四个突变之外，插入了一个额外的Crispr-Cas9诱导的致癌突变pik3caek。这两项研究都表明APC和TP53突变的类脑器官表现出加速的错分离和广泛的非整倍体，这是CRC在CIN通路中进展的标志。此外，在结肠癌有机化合物43中，持续的染色体不稳定性已被证明对肿瘤进化具有重要影响。
然后，将这些工程化的类器官移植到免疫缺陷小鼠体内，研究每个突变对侵袭和转移的贡献。Qmos的皮下移植使转移性肿瘤的发展具有高增殖率和多种侵袭特征，包括一个不规则的多层上皮，由核质比增加的肿瘤细胞组成，具有多形性和深染色质的细胞核，以及肿瘤细胞的小聚集体渗透到Stroma38中，而在没有Smad4突变的三突变类器官(APC、krasg12d和TP53)中，只有腺瘤形成，无侵袭特征。此外，肿瘤是在肾包膜下植入qmos后形成的，但是它们未能移植，尽管它们在肝脏形成了包含休眠的肿瘤起始细胞的微转移，这是人类CRC39最常见的转移部位。在年发表的一项研究中，将携带APC、Krasg12d和TGFbr2基因突变的小鼠肠道肿瘤类器官移植到免疫缺陷小鼠的脾脏，导致了高效的肝转移。此外，一些研究现已证明，基因工程结肠类器官或病人来源的CRC类器官能够在原位移植到盲肠40,45,46时形成转移。总的来说，这些模型非常适合于研究转移的要求和进一步评估蛋白质在结肠癌进展中的重要性。
SerratedCRC锯齿状肿瘤
由锯齿状肿瘤通路引起的结肠癌与传统的病理学上的结肠癌不同，预后较差。锯齿状通路是由BRAF癌基因突变的激活引起的，这种突变激活了mapk信号通路，接着是特定目标启动子的广泛超甲基化，称为CPG岛甲基化表型，随后肿瘤抑制基因31,48失活。Fessler等人通过同源重组技术将brafve突变导入人结肠类器官，建立了第一个模拟CRC锯齿通路的类器官培养体系。
年，一个具有多重Crispr-Cas9诱导突变的类器官系统建立了锯齿状通路的模型。通过分析TCGA的基因组数据，首次发现了锯齿状的CRC相关基因改变。选择brafve，cdkn2a(编码p16ink4a，参与癌基因诱导衰老)，tgfbr2(参与TGF信号转导)，znrf2和rnf43(均为Wnt受体降解的重要调节因子)，将这些基因导入结肠类器官小鼠体内。然后通过结肠镜将这些工程化的类器官原位注射到免疫缺陷小鼠的结肠上皮中。结果显示，锯齿状结肠癌有多种特征，包括促纤维细胞间质反应、浸润性生长、黏液分化和肿瘤出芽，以及结肠肿瘤自发转移至肝脏。值得注意的是，注射BRAF突变的类脑未能诱导肿瘤的形成，而移植BRAF和TGFbr2突变的类脑导致浸润性腺癌。移植含有这些和附加突变的类脑器官(cdkn2a、znrf2和rnf43)导致肿瘤启动增加(几乎%的这些小鼠发展成肿瘤，而接受含有BRAF和TGFbr2突变的类脑器官的小鼠有57%发展成肿瘤)，并减少存活时间(对于携带BRAF突变的类脑器官的小鼠，存活时间大于3个月;对于携带其他突变的类脑器官的小鼠，存活时间大于4-6周)。此外，另一项研究也使用Crispr-Cas9技术诱导人结肠类器官中BRAFve和/或TP53上伴有R-spondin融合Eif3e-Rspo2的基因融合，以研究R-spondin驱动的锯齿状CRC的进展。将brafve基因突变的类器官移植到免疫缺陷小鼠体内，可观察到异常隐窝形成，移植植入能力较差，而将BRAFve和TP53基因突变的类器官移植到Eif3e-RSpo2融合的小鼠体内，可形成扁平隆起的病变和“v”形锯齿状扩张的超塑性隐窝结构，同时与单纯移植BRAFve基因突变的类器官相比，移植能力增强。
微卫星是短的DNA序列，重复并分布在整个基因组52中。大约15%的儿童早期拥有属性综合症是由于DNA错配修复系统的功能丧失53。Mmr先生对于纠正复制过程中的DNA错配至关重要，它受mlh1、msh2、msh6和pms2的控制。其中一种蛋白质编码基因的突变或沉默，扰乱了MMR系统，导致微卫星长度增加，而微卫星改变的进一步积累可导致遗传不稳定性。为了建立MSI驱动的CRC的类器官模型，drost等人使用Crispr-cas9技术删除了来自正常人结肠上皮细胞55的类器官中的mlh1。通过比较基因工程类器官的突变特征和癌症数据库中的体细胞突变目录，证实该模型能够显示MSI驱动的CRC特征，因为它的突变轮廓与mmr缺陷型结肠癌细胞的突变轮廓相似。此外，与野生型人结肠类器官对照组相比，mlh1-/-类器官组织的dna突变率高出六倍。小鼠结肠类器官也采用了类似的方法，在这些有机物中产生了微卫星不稳定性。需要进一步的工作，以转化现有的CPG岛甲基化表型和MSI的知识到新的代表性类器官模型系统(病人来源和工程)，并使用这些模型来改善诊断和治疗策略对锯齿状CRC。
Lgr5+intestinalstemcellsinCRCprogression.Lgr5肠干细胞在结直肠癌进展中的作用。
类器官技术也被用来研究lgr5ISCs在CRC级数中的作用。研究表明lgr5iscs通过失调wnt和notch信号通路的激活，促进CRC的增殖、迁移和发育，提示lgr5ISCs可能是CRC56-58的起源细胞。肿瘤消退是立即观察到5天的二聚体治疗删除lgr5从ISCs异种移植患者来源的CRC类器官，但肿瘤最终在几个星期内重新生长与lgr5重新表达平行，从而证明了lgr5iscs59的自我更新和分化能力。小鼠原位肝脏移植并消融lgr5ISCs可消除转移性病灶。值得注意的是，虽然这种治疗限制了原发性肿瘤的生长，但在停止治疗后肿瘤仍然发生快速再生，因此表明消融lgr5ISCs不会导致肿瘤退化60。不典型增生结肠上皮和相关基质(由出芽的上皮性腺瘤细胞组成)中lgr5ISCs的存在与肿瘤分期有关。此外，在来源于患者的结肠腺瘤中分离到的lgr5ISCs中，dkk4(编码wnt途径抑制物)和smc2(编码Lgr5的替代标记物)等CRC特异性基因的表达上调，结肠癌在一种器官复位器中被鉴定出来。这些报告表明lgr5ISCs在肿瘤进展和转移中起着作用，在结肠癌中作为癌症干细胞。针对lgr5ISCs可能是治疗转移性结直肠癌的一个新的治疗机会。
Organoid–microorganismcoculturemodels.类器官-微生物共培养模型。
在过去的十年中，对肠道微生物群在大肠癌发展中的作用有了重要的认识。微生物如难辨梭状芽胞杆菌(前称艰难梭菌)、牛链球菌和梭杆菌等，能够通过破坏免疫系统和改变微生物代谢物62,63的产生，促进CRC的进展和转移。先前的研究已经评估了肠道微生物群与crc64,65之间的关系，并且确定了非侵入性诊断CRC的潜在细菌标志物66,67。通过显微注射将选定的微生物引入到类器官中，已经在许多研究中应用，以模拟宿主与微生物的相互作用，并在其它方面进行了综述。肠道微生物群介导的信号传导可以促进肿瘤的发展，但是肠道微生物群和结肠癌之间的确切因果关系仍然很大程度上是未知的。类有机物技术和新的微生物组培养方法(称为培养组学)现在使得可以直接研究CRC相关微生物对肿瘤细胞的影响的模型的建立成为可能。这项研究是一项新颖而有前途的研究方向对于了解微生物如何在TME中影响结肠癌的发生、发展和转移。
Gastricorganoids胃类器官
胃上皮和肠上皮一样，不断更新，充满快速增殖的干细胞。本实验以小鼠幽门上皮细胞lgr5干细胞和小鼠胃体上皮细胞Troy主细胞为材料，进行了长期的三维培养。需要在“微肠”系统中添加其他培养基成分，包括胃泌素和FGF10(用于细胞增殖和培养扩增为多单位类器官)。值得注意的是，胃脏器官的维持严格依赖wnt3a72。这些类器官与胃腺结构区的芽分布在中央腔周围保持极性。Wnt3a、fgf10和noggin基因的缺失导致lgr5干细胞和Troy主细胞分化为极化的窝细胞、粘液性颈细胞和肠内分泌细胞72、73。类似的方法被用来长期扩展来自人体组织的胃类器官74。此外，本研究还建立了具有生理胃功能特征的类器官模型，用永生化胃间充质细胞75共培养小鼠胃底器官。免疫组织化学染色和流式细胞仪分析证实表窝、粘液颈、内分泌和壁细胞表达丰富，并重现上皮屏障功能、细胞重建和PH反应。此外，HPSCs的定向分化提供了另一种产生胃组织器官denovo23的方法。通过对FGF、wnt、bmp、视*酸和EGF信号通路的调控，人类胃中的类胃器官产生于原始的胃样和凹陷样结构域，以及含有Lgr5干细胞、粘液颈细胞和多种胃内分泌细胞的增殖区。
Helicobacterpyloriinfection.幽门螺杆菌感染。
胃癌是全球第二大癌症死亡原因(占所有病例的8.2%)，尽管它仅仅是全球第六大最常见癌症(占所有病例的5.7%)1。胃癌如此高的死亡率主要是由于诊断较晚，因为临床症状往往只出现在晚期，导致治疗选择有限，而且反应不佳，例如细胞*化疗76,77。因此，迫切需要确定新的诊断和治疗策略，对胃癌具有较低的*性。这种细菌感染了全世界大约60%的人口，它的存在与各种人类胃部疾病有关，包括胃腺癌77、79、80幽门螺杆菌。幽门螺杆菌感染的发病机制和幽门螺杆菌引起的胃病理模型已经在其他方面进行了综述。
一些研究小组已经通过将幽门螺杆菌微量注射到以前描述过的人类胃器官系统，建立了幽门螺杆菌感染的类器官模型，用于幽门螺杆菌致病机制的基础研究。由于大多数现有的组织源性类器官模型缺乏免疫细胞，幽门螺杆菌与胃上皮细胞之间的相互作用可以独立于宿主的免疫反应进行研究。例如，在幽门螺杆菌感染的胃器官中观察到核因子b信号活性的强烈激活和胃上皮细胞增殖的增强，这是幽门螺杆菌感染的标志，因此验证了传统细胞培养结果中关于幽门螺杆菌感染的潜在机制23,74,83。用幽门螺杆菌感染人源性和小鼠源性胃器官，也确定了cd44在幽门螺杆菌感染诱导的胃上皮细胞增殖中的新作用;用cd44抑制剂预处理过的人源性胃器官和cd44缺陷小鼠源性胃器官对幽门螺杆菌感染84没有上皮细胞增殖特征。Wroblewski等人发现claudin-7(一种参与上皮细胞间紧密连接形成的蛋白质)的表达和定位被激活的snai1和-catenin在幽门螺杆菌感染的有机物中所改变。此外，holokai等建立了一个体外模型，通过与宿主免疫细胞共培养人类胃器官，研究胃上皮和t淋巴细胞在感染时的相互作用。提示幽门螺杆菌通过调节免疫检查点及其相关的t细胞功能，可以保护胃上皮细胞免受免疫应答的影响。总的来说，这些感染的类器官模型为研究幽门螺杆菌与胃上皮或微环境之间的相互作用提供了机会。
有趣的是，schlaermann等人发表了一种方法，将3d人类胃组织转移到胶原涂层玻璃上，生成2d上皮单分子层，然后这些器官衍生的原代细胞被h.pylori87感染。与更典型的3d类器官感染模型相比，这种2d方法更容易处理，因为不需要劳动密集的显微注射，同时仍然提供可靠的感染条件。最重要的是，幽门螺杆菌发病机制的关键特征，包括caga磷酸化、细胞空泡化和“蜂鸟”表型(宿主细胞的形态学改变，使宿主细胞伸长和细胞分散成更活跃的表型)，在2d胃器官衍生的平面培养中得到了重现，这种能力在以前的3d感染模型中是缺乏的。然而，二维感染培养不能扩展，因此不能用于评估扩展的幽门螺杆菌感染。除了显微注射成功率低和寿命短之外，这些限制意味着进一步的实验是至关重要的，以提高在类器官系统中模拟幽门螺旋杆菌感染的有效性和效率，以及保持类器官培养中幽门螺旋杆菌感染的形态特征。
Gastriccancercarcinogenesis胃癌致癌作用
深度测序分析已经将胃癌分为四个亚型，它们具有不同的分子特征:EB病*阳性，MSI，CIN和基因稳定性88。年发表的一项研究阐明了患者来源的胃癌类器官的基因型-表型关联，并验证了Crispr-Cas9工程化的胃类器官携带各种胃癌变异的结果89。研究表明，基因改变可以转化为组织病理学转化、R-spondin独立性或其他癌症表型。基因型-表型相关分析表明，这些类器官发育Wnt和/或R-spondin生态位独立的遗传和表观遗传途径不同。值得注意的是，将RNF43和ZNRF43突变导入胃癌类器官足以使R-spondin独立。有趣的是，cdh1和TP53的突变在R-spondin非依赖性胃癌类器官组织中表现丰富，RNF43和znrf43完整。类似的研究已经由seidlitz等人完成，其中人类和小鼠胃癌细胞器生成，代表了四种胃癌亚型中每一种的典型特征和改变的通路。通过类器官和Crispr-Cas9技术的结合，可以加速胃癌发生和发展的分子机制的研究，从而促进未来临床前胃癌药物发现和个体化医学模型的发展。
Oesophagealcancerorganoids食管癌类器官
第一个以食管复层扁平上皮为特征的三维类器官模型是通过将小鼠食管黏膜置于“微肠”中段培养建立的。基底细胞层和基底上细胞层特异性标记的表达证实，这些类器官与正常小鼠食管组织具有正确的分层和相似的形态，与ecm接触的基底样细胞较小，内部基底上样细胞较大，中央角化物变硬。流式细胞角色塑造显示，这些类器官重现了直接从原代组织分离的细胞中所见到的细胞表面的不均一性。
在过去的几年中，人们已经成功地从HPSCs中分离出食道器官类化合物。首先，HPSCs被诱导成最终的内胚层，然后连续操作Bmp、wnt和维甲酸信号通路，将最终的内胚层转化为前肠背侧内脏，并在3D基质培养92中进一步转化为食管器官样细胞。骨形态发生蛋白(Bmp)和转化生长因子(TGF)信号的抑制是HPSCs向食管前体细胞顺序分化的必要条件。使用这些方法，HPSC衍生的含有复层上皮的食管类器官被生成，然后分别用于评价Sox2和Notch信号在食管神经发育和食管前体细胞分化中的重要作用。
食管癌的死亡率在世界范围内居高不下(5.3%)，可分为两大亚型:食管腺癌(EADC）和食管鳞状细胞癌(ESCC)1,2。一项研究建立了ESCC类器官，这些器官来自于成对的活检样本，代表肿瘤和癌旁正常粘膜病人94。在这些条件下，肿瘤源性类器官可以长期培养，但正常黏膜源性类器官只能扩增2-3周。ESCC类器官由高度增殖和非典型肿瘤细胞组成，具有较高的核质比。ESCC类器官和异种移植肿瘤细胞系的细胞表面CD44表达模式和自噬泡含量相似，提示ESCC类器官可以保持功能细胞的异质性。此外，41.7%的ESCC类器官表现出肿瘤抑制蛋白P53的非调节性堆积，这是人ESCC的一个关键特征。
到目前为止，只有少数研究建立了类脑模型。一项研究对患者来源的类EADC器官进行了全面的角色塑造分析，证实这些患者来源的类器官(PDOS)重现了原发肿瘤的形态、基因组和转录组特征。相比之下，许多研究利用barrett食管的组织生成类器官，这是一种EADC的癌前状态。巴雷特食管是一种肠上皮化生，位于胃食管交界处的正常复层扁平上皮被上皮柱状上皮和散布的杯状细胞所取代。Barrett食管起始和发展为食管癌的潜在机制尚不清楚。在此之前，还没有精确的barrett食管模型，可以概括在患有这种疾病的人身上观察到的病理和遗传变化。
Barrett食管类器官可由人barrett食管组织在微肠中产生。然而，这些barrett食管器官只能维持1个月，而加入FGF10可将培养时间延长到3个月。长期(≤6个月)人类巴雷特食管类器官的建立是在年完成的，在迷你肠道培养基中分别用50%wnt3a条件培养基和20%R-spondin-1条件培养基代替商用wnt3a和R-spondin-1条件培养基，并加入前列腺素E。用Crispr-cas9将apc-/-导入barrett食管类器官，使其在培养基中不添加wnt3a和R-spondin-1(参考文献97)。与野生型Apc-/-barrett食管器官相比，Apc-/-barrett食管器官具有多种肿瘤特征，凋亡减少，增殖和复制活性增强。
值得注意的是，没有研究报道来自正常人类食管鳞状细胞的类器官长期成功通过，这表明目前的培养条件可能不适合高分化鳞状细胞的繁殖27,94,98。有趣的是，vonfurstenberg等人报道了一种新的类器官模型，该模型来自猪食管粘膜下腺，由于人类和猪食管99的组织学相似性，它可以促进人类食管类器官的发育。在多重转基因小鼠模型中，移行柱状上皮中发现一组p53krt5krt7祖细胞，可能是barrett食管起源的细胞。Cdx2的异位表达(编码转录因子在barrett食管中的表达增加)，这些祖细胞分化为肠道样上皮，随后复制barrett的化生。虽然类器官技术已经使人们对巴雷特食管的发病机制有了更深入的了解，但目前还不清楚这种疾病是如何发生并发展成恶性肿瘤的。因此，巴雷特食管发病机制和癌变的综合模型尚未建立。
Hepaticcancerorganoids肝癌类器官
肝细胞是最丰富的肝细胞类型(包括大约60%的肝细胞)，来自肝祖细胞(IPCs)。肝细胞被认为居住在连接胆管和胆管的交界结构中，并被认为具有非常低的增殖率。肝损伤后，肝细胞增殖活跃，分化为肝细胞和胆管上皮细胞，促进肝和胆管再生。Lpcs在肝脏再生中的作用已在其他文献,中进行了综述。然而，到目前为止，由于没有确凿证据证明存在居民地下储油罐，地下储油罐的起源仍然存在争议。与传统的lpc理论相反，过去几年发表的研究发现，成熟的小鼠肝细胞，在肝损伤后，可以重新编程为增殖的双能IPCs，然后进一步快速增殖，重建肝质量-。
建立肝脏器官的方法很多。在中*性损伤时，lgr5细胞可以在胆管附近的小细胞中发现，这些细胞可以产生器官。这些来源于小鼠的类器官在微肠培养基的改良版本中扩增(Noggin和wnt3a仅在接种后的3-4天内包含)，扩增时间大于8个月。基因表达分析显示肝细胞和胆管的Lgr5和祖细胞标志物sox9、cd44和prom1上调。多种肝细胞谱系标记和胆管标记在克隆性类器官中的表达表明这些lgr5细胞具有生物活性。通过抑制Notch和TGF信号，肝脏类器官在体外分化。此外，在免疫缺陷小鼠脾内注射后，这些类器官成熟为功能性肝细胞。在一项后续研究中，从人类肝脏活检标本中分离出来的epcam导管细胞能够在体外扩增为双能祖细胞，形成具有胆管样表型的三维肝脏器官，同时保持其遗传稳定性超过6个月。将Camp信号激动剂forskolin(campsignalagonist)从培养基中提取出来，在培养基中加入缺口抑制剂FGF19、地塞米松和Bmp7后，这些类肝细胞器在体外分化为功能性肝细胞，并移植到免疫缺陷小鼠体内。人类和鼠类胆囊器官之间需要类似的培养条件才能长期扩张。去除R-spondin-1、Noggin和烟酰胺诱导这些类器官分化为肝细胞。Sampaziotis等人开发了一种替代培养方案，将dkk1(wnt信号抑制剂)加入R-spondin-1含有培养基中，生成来自人肝外胆管树的长期胆管细胞器。这些类器官表达多种胆汁标志物，包括krt7、krt19和sox9，一旦移植到小鼠体内，能够自组织进入胆管样管道。有趣的是，一项研究表明，来源于人胎儿肝细胞的类器官可以在非细胞肝脏特异性ECM支架上自组装。与以往的方法不同的是，这些类器官能够利用单一培养基组合重现同步肝脏器官发生，这是通过将以前描述的肝脏类器官的培养条件与含有抗坏血酸、地塞米松、胰高血糖素、高密度脂蛋白、游离脂肪酸混合物和昂卡汀m的分化培养基耦合起来实现的。
肝脏由不同类型的细胞组成，但大多数肝组织衍生的类器官含有同质的细胞群。Takebe等利用内胚层上皮细胞、间充质细胞和内皮祖细胞之间的信号传导来产生由异质细胞群组成的人肝芽样器官24。首先将人脐静脉内皮细胞诱导分化为肝内胚层细胞，然后与人脐静脉内皮细胞和人间充质干细胞共培养。值得注意的是，虽然这些细胞是在2d条件下镀膜的，但它们自组织成3D肝芽样细胞群。移植到免疫缺陷小鼠体内后，这些肝芽样的聚集体连接到宿主血管并在48小时内形成血管，它们表现出执行肝脏特异性功能的能力，包括蛋白质生成和人类特异性药物代谢。移植后几周的组织学检查证实肝芽样器官已成熟为类似成人肝脏的组织。一项后续研究报告了在HPSCs的3D培养中肝脏、胆管和胰腺结构的连续模式和动态形态发生。经过90天的培养，来源于hpscs的肝-胆-胰脏器官类器官能够发育成分隔的多器官组织，并随后重现早期的形态发生事件，包括三个不同但相互连接的器官结构的内陷和分支。
根据年公布的数据，原发性肝癌是第七大最常见癌症(占所有病例的4.7%)，但其死亡率与胃癌相同(占所有病例的8.2%)1。大多数原发性肝癌可分为肝细胞性肝癌(hcc，高达80%的原发性肝癌)和胆管癌(cca，高达15%的原发性肝癌)。剩下的5%一种罕见的原发性肝癌亚型，联合肝癌cca,。目前对原发性肝癌的治疗选择，如化疗和分子靶向治疗，疗效低，效果不显著，原发性肝癌5年复发率可高达%，缺乏准确的人体模型系统，限制了新型治疗方法的发展。发表于年和年的两项研究，建立了长期的原发性肝癌类器官来源于接受肝切除或肿瘤针活检的患者。为了避免非癌细胞的生长，通过补充经典培养基，加入地塞米松和rho激酶抑制剂y-，去除r-spondin-1，noggin和wnt3a。这些类器官的基因表达谱与tcga数据进行了比较，证实了已建立的肝细胞癌标记(afp和apoh)和cca标记(krt7)都有表达。此外，还保留了原始肿瘤的组织学特征(致密的结构、不规则形状的囊肿样结构、健康肝脏中有序的囊肿样中空结构)和体细胞遗传学改变。移植到免疫缺陷小鼠后，观察到肺转移，提示原发性肝癌的类器官可以模拟其原发肿瘤的转移特征。此外，在年，从小鼠原发性肝肿瘤中提取的原发性肝癌类器官的繁殖时间至少为3个月，而从肿瘤类器官中分离出来的单个细胞足以启动免疫缺陷小鼠移植后的肿瘤形成。有趣的是，不同类型的肿瘤细胞器表现出不同的表达模式ーー一些表达肝癌标记物(afp和hnf4a)，一些表达CCA标记物(ck19和epcam)，其他表达肝癌和CCA标记物，从而证明了患者肝癌类型的异质性。
此外，还发现了一种罕见的原发性肝癌亚型，即联合型肝癌-CCA，它比传统型肝癌具有更强的攻击性行为，无复发生存率和总体生存率更低，表现为hcc表型与CCA-like基因表达模式或混合型肝癌-CCA病理学家,。在li等人的一项研究中，类器官来自于一个转基因肝癌小鼠模型的肿瘤(prom1c-l，ptenflx/flx，tp53flx/flx和rosazsg)，并原位注射到免疫缺陷的mice。有趣的是，移植后生成的肿瘤的基因表达谱与原发性肝癌和CCA肿瘤相似，并与联合的原发性肝癌CCA有很大的形态相似性，这表明在进展到晚期的原发性肝癌过程中可以获得CCA特征。
类器官已被用于研究原发性肝癌的分子机制及其相关危险因素。例如，prmt6(精氨酸甲基化的一个转录因子)在患者肝细胞癌中的过度表达减弱了肿瘤细胞的迁移和侵袭，而prmt6通过crispr-cas9基因敲除在患者肝脏中的非肿瘤类器官中表现出增强的细胞对化疗和分子靶向药物的抵抗力。非酒精性脂肪性肝病与肝癌有关，因为它可以导致脂肪性肝炎，最终导致肝纤维化，肝硬化和hcc。Leite等建立了一个药物诱导的类肝纤维化模型，将永生化的肝细胞系和原代人星状细胞共同培养，然后将类肝纤维化细胞暴露于纤维化复合物中。这些类器官具有人星状细胞活化、胶原分泌和沉积等纤维化特征。为了模拟脂肪变性，kruitwagen等人在人类、小鼠、猫和狗的肝组织中，加入了过量的游离脂肪酸。游离脂肪酸处理后，人源性和猫源性肝脏类器官中srebf1(一种从头生成脂肪的转录因子)的下调表达和增强氧化和脂滴形成。这两种类器官之间有不同的转录谱(例如，pparg的表达，一种促进氧化的转录因子，在人类类器官中没有变化，但在猫类器官中上调)，这表明人类和猫之间脂质调节通路的激活存在差异。年发表的一项研究建立了一个类器官模型，通过将原代人肝细胞(80%)、枯否细胞(10%)、肝星状细胞(5%)和内皮细胞(5%)在重力聚集培养中混合，研究mir-(肝脏中最丰富的微RNA)的抑制作用。在mir-抑制作用下，细胞死亡增加，炎性细胞因子(IL-6和TNF)、趋化因子(ccl2和ccl3)和基质金属蛋白酶(mmp8和mmp9)表达增加，导致肝细胞器炎症、坏死、脂肪变性和纤维化。
此外，乙肝病*感染是原发性肝癌的一个公认的危险因素。通过修改前面描述的方法，长期hpsc衍生的肝脏类器官随后产生乙肝病*感染。乙型肝炎病*感染的类器官表现出早期急性肝衰竭标志物(丙氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶)和上皮-间充质转化标志物(snai2和twist1)的上调表达，以及肝细胞胞浆中空泡增多，导致细胞核向细胞周围推移，以及膜微绒毛数量减少，所有这些都是肝纤维化的特征。因此，肝脏类器官是研究原发性肝癌的有力工具。未来利用肝脏类器官的转化研究可能为开发新的治疗原发性肝癌及其相关危险因素的治疗策略提供新的见解。
Pancreaticcancerorganoids胰腺癌类器官
人类胰腺由三种主要细胞类型组成:导管细胞、内分泌细胞和腺泡细胞。与肝脏相似Wnt信号不活跃，健康成人胰腺中缺乏Lgr5。胰腺损伤时Wnt信号强烈激活，Lgr5的表达仅在胰腺导管处上调。通过将分离的小鼠胰腺导管细胞在“迷你肠道”培养液中加入FGF10，培养出长期的3D胰腺器官样细胞。随后的分析显示，这些类器官中有导管标记物(Lgr5，pdx1，krt19和sox9)的表达，这些标记物可以在免疫缺陷小鼠移植后沿导管和内分泌谱系分化，从而证实了它们的双潜能。类似的观察也是使用人类胰腺组织衍生的有机物s。相比之下，来源于HPSCs或小鼠胚胎胰腺祖细胞的胰腺类器官不仅产生于导管和内分泌结构，而且产生于卵*、的腺泡结构。有趣的是，dorrell等人发现，来自小鼠肝脏和胰腺的有机类启动细胞的转录组广泛重叠，并在体内移植胰腺类器官到免疫缺陷的FAH-/-小鼠(一种能够复制人类肝细胞的人源化小鼠模型)，甚至产生肝细胞样细胞，这表明两个祖细胞之间的密切关系。
胰腺导管腺癌(PDAC)约占所有胰腺恶性肿瘤的90%，诊断后5年生存率为10-20%，平均6-12个月生存率分别为。肿瘤抑制基因(tp53、cdkn2a、smad4和brca2)的失活可以促进PDAC-的进展。为了研究PDAC的发病机制，boj等人开发了第一种从人PDAC样本中提取类器官的方法。这些PDAC类器官是高度非整倍体，并显示导管上皮细胞标记，但不代表其他两个胰腺系列标记。PDAC类器官在免疫缺陷小鼠原位移植后，产生胰腺上皮内瘤样病变(panin，PDAC最常见的前体)，并在数月内进一步发展为浸润性癌，包括浸润性腺体。这个观察表明类PDAC可能能够重现肿瘤进展的全过程。
用慢病*表达krasg12v和/或tp53rh的载体感染hpsc衍生的胰腺类器官，也报道了由hpscs产生的PDAC类器官的建立(参考文献)。移植到免疫缺陷小鼠体内后，这些器官诱导形成具有早期转化特征的病变，包括导管组织病理学和核形态学的异常。在直接接触空气的气液界面上培养小鼠胰腺来源的类器官也观察到了类似的结果，从而使类器官能够在没有外源性生长因子补充的情况下生长。
年和年发表的两项研究，应用crispr-cas9基因编辑技术修饰人类胰腺导管类器官中的pdac驱动基因，包括krasg12v、cdkn2a、tp53和smad4(以下分别为k、c、t和s)，这些基因的突变体要么被过量表达，要么被敲入器官ids。在免疫缺陷小鼠异种移植后，不同组合的突变体表现出不同的panin特征，但只有kcts的突变体表现出严重的结构变形，包括与PDAC组织病理学转化相对应的核异型和肿瘤芽生。但是，kcts类器官只发育出与人类panin相似的细胞和分子特征，包括高柱状细胞，细胞核基部有粘液质，以及原位移植到免疫缺陷型mice时很少甚至没有磷酸化akt免疫反应。有趣的是，wnt去除后1-3周，kc和kt类器官灭绝，而kct和kcts类器官在wnt去除的培养条件下存活和扩张至少3个月，这表明cdkn2a和tp53突变对wnt类器官发育至关重要。此外，还识别了3种不同wnt依赖程度的PDAC子类型。综上所述，这些结果表明，在伴有crispr-cas9诱导的序列突变的类器官中，从panin到pdac的肿瘤发生和发展过程可以被精确地重现。此外，一些研究已经阐明了如何使用类器官模型来调查各种因素的作用，如氧化还原调节因子nrf2(参考文献)和转录增强子foxa1(参考文献)在pdac进展中的作用。需要进一步开展工作，将改进的分子机制知识转化为临床效益，以便开发新的早期检测工具和治疗PDAC的选择。
OrganoidmodelsoftheTME
特异性基因突变对肿瘤行为的影响可以在体外细胞器培养或体内移植模型中进行研究，这也使我们能够研究对TME的影响，包括对免疫反应和基质相互作用的影响。众所周知，ISCs的静止、增殖和再生受微环境中不同细胞的调控。TME中的基质细胞，如内皮细胞、免疫细胞和癌相关的成纤维细胞(cafs)，可以大大促进肿瘤发生(通过诱导自我更新的癌细胞亚群促进肿瘤生长和维持肿瘤干细胞)、转移(通过介导定向迁移和促进异常细胞粘附以削弱ECM)、药物和治疗耐药(通过刺激耐药因子snail的表达),。在大多数类器官模型中，这些组分是缺乏的，然而，包括一个或多个这些组分的共培养系统正在发展，包括与脂肪细胞，淋巴细胞,，巨噬细胞,和肌纤维母细胞,的类器官共培养。将小鼠胃组织器官与永生化间充质细胞共培养，诱导多重成熟胃细胞系(前面讨论过)和功能性上皮细胞82。
与免疫细胞或其他细胞类型的类器官共培养已被应用于许多研究，以评价TME在肿瘤进展中的作用。比如说,一项研究报道，在气液界面保存的基质结构中培养PDOS与功能性肿瘤浸润淋巴细胞和一个完整的T细胞受体谱与功能性细胞程序性死亡蛋白1-pd-l1依赖性免疫检查点系统。与对照组小鼠共培养的胃组织相比，三联转基因胃癌小鼠模型与骨髓来源的树突状细胞共培养的胃癌组织中pd-l1的表达增加，从而引起肿瘤细胞增殖。将小鼠CRC类器官与脂肪细胞共培养，可促进肿瘤细胞的增殖、去分化和侵袭性。当人肝癌细胞器与内皮细胞或纤维母细胞共培养时，可观察到新生血管生成因子(血管内皮生长因子和缺氧诱导因子-)、炎症因子(cxcl12和tnf)和上皮间充质转化因子(TGF和mmp9)的表达增强。此外，小鼠PDAC器官和胰腺星状细胞共培养模型显示了咖啡因亚群的功能异质性，包括一个平滑肌肌动蛋白表达的肌纤维母细胞和一个IL-6表达的炎症性CAF。Il-1诱导的jak-stat信号通路的激活是炎症性cafs形成的原因，此外，TGF通过下调IL-1受体的表达和促进CAFs向肌纤维母细胞的分化来拮抗炎症性CAFs的形成。
此外，我们还利用从人体组织或活组织样本中提取的基质，用洗涤剂和酶去除细胞，研究了ECM在TME中的作用，建立了3D培养系统,。这些组织衍生基质在生物学上与生物体相似，因为细胞基质粘附、细胞骨架和整合素等ECM成分以及包括生长因子和细胞因子在内的信号传导介质都被保存了。从健康人结肠和大肠癌标本中去细胞化的细胞外基质的比较显示细胞外基质对肿瘤发生和血管形成的贡献。例如，CRC衍生的ECM细胞增殖率比正常ECM高40%，但同时，CRC衍生的ECM抑制癌细胞侵袭的能力下降。类似的研究发现，健康的人结肠癌和结肠癌细胞外基质在蛋白质组成、血管网形成和肿瘤生长方面存在很大差异。结肠癌细胞外基质显示出促进肿瘤血管生成和肿瘤及血管代谢物转移的能力。因此，在未来的研究中，若干个预后和诊断基质标记物被确定后，靶向ECM可能是一个潜在的抗癌治疗选择。
Applicationsoforganoidsintranslationalresearch类器官在转化研究中的应用
在类器官模型中重述人类癌症，使我们能够更好地了解肿瘤发生和恶性进展的机制。下一个挑战是利用这些信息来改善治疗。高通量筛选主要是利用传统的癌细胞培养进行的。然而，基于这种方法的药物发现项目在随后的临床试验中有很高的失败率，这在一定程度上是由于原始肿瘤多种特征的癌细胞系表现不佳，如瘤内遗传异质性，以及TME5,6缺乏细胞成分。
另一种典型的癌症模型是病人来源的异种移植物(PDX)，它是通过从病人身上分离肿瘤细胞并将其移植到免疫缺陷的小鼠体内而产生的。由于PDXS几乎可以完全重现肿瘤的表型和基因型，它们已被用于生物标记物检测和临床前治疗评估。然而，PDX模型是昂贵的和有限的要求大的组织样本和繁殖时间长，以及缺乏一个完整的免疫系统。因此，PDX模型不适用于高通量筛选目的(表3)。
Organoidsfordrugscreening药物筛选用类器官
PDOS为药物发现和测试提供了一种令人兴奋的新的替代方法。与传统的癌症模型相比，PDOS只需要建立较小的组织样本，例如内窥镜检查或细针抽吸取样37,,,。与PDXS相比，PDOS可以以更低的成本和更短的传播时间生成，而保留瘤内异质性。多项研究已经将PDOS用于药物筛选,，确定潜在的治疗选择89,98，模拟化疗对CRC的有效性和药物对HCC,的反应性，以及模拟ESCC80的治疗耐药性。其他组使用HPSC衍生的类器官模拟药物引起的肝衰竭，并进行药物筛选和PDAC和CRC测试。此外，类有机化合物还可用于罕见癌症和疾病的高通量筛选和药物开发，如鼻咽癌、阿拉吉欧综合症和脂质体酸性脂肪酶缺陷,。
Organoidsforpersonalizedmedicine.用于个体化医学的类脑。
在开始将器官技术应用于临床方面做出了巨大的努力，特别是在个性化医疗领域。原则上，PDOS可使受影响组织的药物反应快速体外测试成为可能。由于可以在组织衍生后的几周内产生结果，该系统具有作为个性化治疗选择平台的潜力(图2)。例如，通过测量囊性纤维化患者的直肠类器官中囊性纤维化跨膜电导调节器的功能，可以识别哪些人将受益于囊性纤维化跨膜电导调节器-纠正治疗。对于癌症，尽管在临床前研究中，类器官能够进行高通量筛选，但尚不清楚肿瘤的遗传结构是否能在PDOS中保存下来。为了回答这个问题，weeber等人对来自转移性CRC37患者的14个器官中的个癌症相关基因进行了全基因组测序。结果表明，在同一患者的CRC类器官和活检样本之间，体细胞突变有90%的共享，DNA拷贝数谱的相关性为0.89。在一项研究中比较56pdo和19的同行PDX从年各种癌症患者,包括结肠癌,PDO和PDX显示保护本地肿瘤的组织病理学特征,包括增加细胞增殖和形成的腔见人类CRC和PDAC。这些发现表明PDOS能够捕获原发肿瘤的基因组和表型特征，因此为在个体化癌症治疗中应用类器官提供了强有力的证据。
其次，大样本量的转化研究是必要的，以确保药物筛选结果是可靠的，并承担与癌症患者的关联。几个大型的PDOS的各种类型的胃肠道癌症现已建立和拥有属性基因组测序，表达谱和药物筛选，从而将遗传和转录信息与药物反应联系起来35,36,,。迄今为止，大量的研究已经利用PDO生物基因组对胃肠道癌变患者进行个性化药物筛选(表2)。例如，vandewetering等人从20名CRC患者中建立了一个类器官生物库，并进行了全基因组测序分析，以确保这些类器官保留在原始肿瘤中检测到的癌症亚型。一组83种化合物的highthroughput，包括临床使用的药物(n=25，包括西妥昔单抗、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶)、化疗药物(n=10)、临床试验中的药物(n=29)和实验化合物(n=29)，发现，例如，RNF43器官类化合物对wnt分泌抑制剂(o-acylporcupine)敏感突变，而kras-mutant器官类化合物是抗egfr抑制剂西妥昔单抗和阿法替尼受体的抗药性转移酶。在年发表的一项研究中，采用了类似的方法，但规模要大得多。高通量筛选种药物，其中包括fda批准的药物(如硼替佐米和索拉非尼)和具有已知靶点的小分子，对来自CRC患者的类器官进行了筛选，并使用来自biobank的其他CRC类器官评估了几种“命中”药物的反应性。建立了胃癌PDO生物链90、、EADC95和原发性肝癌PDO生物链，并用于药物筛选和检测，为癌症患者的治疗选择提供依据。
虽然在类器官生物库上使用高通量测序的确显示了胃肠道癌症个性化治疗的良好趋势，但重要的是确定体外基于类器官的药物敏感性或耐药性测试是否能真正代表患者的结果。因此，需要在临床试验中进行广泛的工作，以比较临床前模型中的药物反应和患者的实际反应。在年发表的一项研究中，首次通过使用i/ii期临床试验中招募的转移性结直肠癌和胃食管癌患者的PDOS生物样本，证明了PDOS在个体化医学中的预测价值。比较了化疗敏感型和化疗转移型胃食管癌患者对5-氟尿嘧啶和顺铂联合一线治疗的体外反应，化疗敏感型PDOS的gi50(50%抑制癌细胞生长的浓度)比化疗敏感型PDOS的gi50高10倍。为了测试临床上观察到的对regorafenib的反应是否与PDOS中观察到的反应一致，PDOS被原位移植到免疫缺陷小鼠的肝脏中，生成异种移植瘤。来自对regorafenib敏感的患者的PDO异种移植物的微血管明显减少，而对regorafenib耐药的患者的PDO异种移植物没有统计学上的显著变化。值得注意的是，PDOS能够捕捉到对regorafenib的获得性抵抗;治疗前和治疗后的PDO异种移植物是从一个转移性CRC患者建立的，该患者对regorafenib治疗表现出初步反应，随后肿瘤进展。预处理后的PDO异种移植组微血管数量减少约60%，而治疗后的PDO异种移植组无统计学意义上的显著变化。
另一项研究显示了PDOS作为预测胃癌患者靶向治疗的临床前工具的潜力。采用表阿霉素、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶等胃癌标准化疗药物治疗。值得注意的是，每个PDO显示出对这些药物的反应，这些反应与他们相应的病人中观察到的反应相关。例如，来自对化疗有完全反应的胃癌患者的类器官对治疗很敏感，而来自对化疗没有反应的胃癌患者的类器官对治疗有抵抗力。此外，随后将PDOS移植到免疫缺陷的小鼠体内，能够形成表型类似于相应患者的天然肿瘤组织的肿瘤。PDOS的临床相关性也显示在一个类似的研究中，利用了从pdac患者中提取的PDOS库。耐化疗的PDOS对靶向药物表现出特殊的敏感性，例如，对4种化疗方案(5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、伊立替康和奥沙利铂)耐药的PDO对广谱激酶抑制剂sunitinib敏感，提出了抗趋化因子PDAC的替代治疗方案。此外，最有可能从化疗中获益的PDAC患者可以通过建立PDO衍生的化疗敏感性相关基因标记来预测。例如，对奥沙利铂信号富集的患者对四种化疗方案的肿瘤反应比对照组好，而对5-氟尿嘧啶信号富集的患者则没有这种相关性。此外，年发表的两项类似研究测试了转移性CRCPDOS对化疗的敏感性(41例患者中有65例PDOS，61例患者中有40例pdos)。有趣的是，PDOS移植到免疫缺陷小鼠后，侵袭性结肠癌形成，移植的肿瘤对化疗表现出不同程度的敏感性，包括临床观察到的5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙和奥沙利铂。相比之下，PDOS能够预测80%以伊立替康为基础的治疗的患者的预后，但在体外药敏试验中未能预测5-氟尿嘧啶加奥沙利铂治疗的患者的预后。
此外，YAO等人已经报道PDOS可以预测局部晚期直肠癌的放化反应。在他们的研究中，96大肠杆菌类器官从80名患者，与保存的病理生理学和遗传变化，他们的相应肿瘤用新辅助放化疗(特别是照射，5-氟尿嘧啶或伊立替康)治疗。值得注意的是，PDOS的放化反应与相应患者的实际反应高度匹配，准确率为84.43%，敏感性为78.01%，特异性为91.97%。例如，34名患者获得了良好的临床反应，而且他们所有的PDO对三种治疗方法中的一种都敏感。同时，从34名反应较差的患者身上获得的PDOS，对辐射和药物都有耐药性。有趣的是，19名患者对放化疗反应良好，而他们相应的PDOS对照射有抵抗力，但对5-氟尿嘧啶或伊立替康敏感，这表明这19名患者可能不需要照射。总的来说，这些数据表明PDOS可以用来预测患者的结果，并且可以使用适当的化学放射或化疗药物来降低患者的*性。
除了作为靶向治疗的临床前模型之外，PDOS还可以作为基础研究和转化研究之间的纽带。例如，舒马赫等人。采用来自例结肠直肠癌患者的91例具有良好特征的PDOS，研究了瘤内异质性对药物反应的影响。有趣的是，遗传学，转录组和抑制剂反应异质性被发现在多取样的类器官模型来自一个单一的kras突变原发肿瘤。值得注意的是，通过靶向蛋白质组分析发现了mapk信号通路激活的异质性，这种异质性与EGFR抑制的可变反应有关，但与ras突变无关。例如，在吉非替尼(一种用于抗EGFR治疗的小分子)敏感的pdos和吉非替尼抗药的PDOS之间，观察到了不同的激活mapk通路的模式。因此，PDOS的使用使肿瘤形成和发展的分子特征和机制被用来改善癌症患者的治疗反应预测。综上所述，这些发现表明PDOS的预测价值和临床潜力是有希望的，PDOS值得在癌症患者的前瞻性临床试验中进一步评估。
Limitationsoforganoids类器官的局限性
类器官是研究人类发展和疾病的有力工具。但是，必须注意它们的局限性(表3)(图3)。由于类器官模型的快速发展，研究人员正在使用不同的培养方法开发类器官模型。特别是，人体组织衍生的类器官是在每个实验室的不同培养条件下产生的。利用各种细胞系产生的生态位因子在培养基中培养类器官已经比利用商业生长因子更为普遍，从而降低了维护成本。这种趋势不可避免地将实验变异引入整个科学界的类器官研究中。
另一个实际的局限性是，在大多数类器官模型中，必须使用基质胶或其他动物源性基质，以使细胞聚集成三维结构。然而，这些基质的组成并没有明确的定义，而去除基质胶对于后续的程序包括DNA或RNA分离、Crispr-Cas9编辑甚至深低温保存都是至关重要的。一些研究已经开发了其他基于支架的技术，或者设计了新颖的独立于基质的平台，作为广泛使用的基质的潜在替代品。例如，在鉴定了肠道类器官形成的关键ECM参数后，gjorevski等人发表了一个对类器官培养具有最小环境的培养系统。特别是，高基体刚度有利于通过yap依赖的机制扩展ISCs，而软基体促进层粘蛋白为基础的粘附，是ISC分化和类器官形成所必需的。这种定义明确、环境最小的培养体系可以适应组织发育、稳态和修复过程中的动态需要。另一项研究开发了一个以水凝胶为基础的平台，促进胰腺祖细胞自发聚集成具有增强胰岛表型的类器官，增加胰腺标记物Pdx-1和nkx6.1的表达，以及丰富的细胞群体，这些标记物在自组织过程中共表达成3DIDS。
癌细胞器模型是为了克服以往体内研究的限制而开发的，但是它们缺乏非癌细胞成分，包括间充质组织、神经细胞和免疫细胞。因此，它们不能完全概括各个器官的整体结构和功能。许多研究小组试图通过共培养具有不同细胞类型的类器官来解决这个问题(见上文)。例如，几个以HPSC为基础的类器官能够进行间充质分化，产生上皮下肌成纤维细胞和平滑肌细胞。值得注意的是，目前大多数类器官模型维持在未分化状态，以支持长期繁殖，类器官只有随后通过修改扩展介质才能区分。为了使分化的细胞能够稳定和自然发生，需要非常规的类器官培养方法，如使用气液界面、、或创建人工生长因子梯度s。
获得纯的癌细胞器是研究人员面临的另一个关键问题。许多研究报道，肿瘤的类器官实际上可能过度生长和受到来自健康肠道的正常类器官和胃上皮细胞89,，以及来自肝脏和胰脏的组织的污染。目前，获得纯肿瘤类器官最广泛使用的方法之一是选择肿瘤细胞携带相应癌症中最常见的突变，如磷酸二乙酯有机化合物和TP53胃癌有机化合物89,。然而，这种方法并不适用于所有癌症，某些特定的癌症亚型，以及瘤内/瘤内异质性，在选择时将不可避免地丧失。一些实验室建议根据癌细胞的生长表型获得纯的癌细胞器。例如，wallaschek等人描述了获得人类胃癌类器官纯种群的多种分步方案，随后通过测序、药物选择验证癌症特性,核型分析和组织学。然而，并非所有的癌类器官与正常类器官有明显的形态差异。例如，正常结肠类器官与几个CRC驱动基因突变仍然生长为组织良好的类器官与一个明确的管腔38,39。需要更多的研究，以建立适当的方法获得纯肿瘤类器官模型的其他胃肠道癌症。
此外，就肿瘤类器官的培养条件而言，由于培养方法可能不能同等有效地促进所有肿瘤亚克隆的生长，因此在连续培养过程中可能会失去瘤内异质性。此外，如前所述，2D细胞培养中经常发生遗传异质性，这可能导致进一步的遗传变异和不稳定性。同样的现象也可能发生在3D类器官培养中，但是在长期培养过程中是否会获得新的突变尚不清楚。总的来说，这些限制值得进一步
