流式细胞术（FCM）是一种对液流中成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。常见标本类型有血液、骨髓、体液等，但采用组织标本的流式技术在血液肿瘤（包括淋巴瘤）诊断中的价值一直以来被低估或未得到充分认识。
为了帮助大家更好地了解组织标本流式细胞术，高博流式创新研究院系列课程再次邀请高博诊断中心流式细胞实验室喻新建主任，为我们分享《组织标本流式检测的标本制备和注意事项》的精彩内容。
一、组织标本流式的价值
了解组织标本流式细胞术的基础首先是知道哪些组织标本可以做流式。事实上，除了本来就是液体的标本（如骨髓穿刺标本，外周血，体液和细胞培养标本等）外，新鲜的实体组织标本，无论是活检还是穿刺获得的，均可以进行流式检测，只需要将其制备成液体状态（细胞悬液）即可。
在国内，目前临床医生送检组织标本做流式检测的比较少，但是已有充分的研究证据证实，组织标本流式检测对于血液肿瘤诊断的重要意义。一项年发表在CytometryPartB:ClinicalCytometry杂志上的研究（n=1,）结果表明，对疑似淋巴瘤的组织样本常规进行流式检测是非霍奇金淋巴瘤（NHL）形态学诊断的基本辅助手段，可以提高组织学评估的性能，从而实现精准诊断。
在喻主任看来，虽然与病理诊断相比，流式细胞术可能会有一些局限，如不能保持组织结构，标本无法保存做后续分析，胞浆和胞核标记存在一定困难，对某些疾病或细胞类型意义有限等，但快速、简便、特异、敏感和客观的特点，足以让流式细胞术在多种实验室检测技术中脱颖而出。然后喻主任通过几个实例，表明组织流式检测具有快速诊断、为病理做先锋探路、弥补病理短板、有利于选择靶点等价值，因此值得实验室和临床工作者学习和了解。
喻主任还展医院过去2年组织标本流式检测的统计结果，让大家认识到组织流式细胞术可以和病理诊断技术相互补充和验证，已经成为以髓外肿物为首发症状的血液肿瘤诊断的重要手段，因此临床医生和病理医生应有意识地主动把组织流式检测整合到血液肿瘤诊断中。
那么组织标本应该怎样送检呢？关键点是在保证细胞活性的同时，得到足够多的可分析细胞。
首先在取材上，主要通过（超声或CT定位下）细针或粗针穿刺，少数情况下手术切除的方式。针穿应多方向（扇形），多取（-5条）；手术组织块应不小于5mm。取材后立即完全浸入生理盐水中，用细胞培养基（如RPMI液）更好。注意千万不能放到固定液里。
其次转运方面，应尽快（24hr，最长不超过48hr）送达实验室。建议全程冷链，切记不能冷冻，勿用干冰。
下面喻主任详细介绍了组织标本类型、取样和细胞分离的具体方法。
二、组织标本的类型划分
组织标本按组织来源可分为肝脏、心脏、脾脏、肺脏、神经系统（脑或脊髓）、脂肪组织、血管、肿瘤组织等；按纤维组织的多少可分为软组织（连接疏松的组织）和硬组织（连接致密的组织）两类，其中免疫器官组织多属于软组织，其他器官组织多属于硬组织。软硬组织的分类方式更有助于组织标本处理方法的选择。
三、组织标本取样注意事项（表1）
表1组织标本取样注意事项
四、组织标本的细胞分离方法
制备组织单细胞悬液是检测成功的基础，直接影响流式检测的最终结果，因此需要根据组织特性选择合适的解离方法。目前有三种细胞解离方法，分别是机械解离、酶解离和化学解离（后两种也可合称为消化解离）。
1、机械解离
原理：是指利用物理方法（机械法）分散组织，经过滤网过滤获得单细胞悬液。
应用：常用于处理纤维成分少的软组织例如胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织如淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、脑瘤以及一些软组织肉瘤等。
优点：操作简便，快速。
缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用；对硬组织或纤维组织效果不好。
根据具体操作方法的不同，机械解离可以分为以下三种：
①吹打法：用移液枪、吸管或注射器针头反复吹打组织；
②剪碎研磨法：用锋利的剪刀将组织剪碎后，用组织研磨器或注射器针栓研磨；
③网搓法：组织放在不锈钢或尼龙筛网上轻搓冲洗。
2、酶解离
原理：利用酶破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞。
应用：适合致密的组织样本，如上皮、肝、肾等或含有大量结缔组织的肿瘤如食管癌、乳腺癌、皮肤癌等。
优点：适用于大部分组织样本获取单细胞，酶的种类多选择空间大。
缺点：操作步骤比较繁琐，消化时间比较长且难控制。不同的组织样本酶种类、浓度、消化时间的选择需要不断摸索优化。对后续流式抗原检测有不利影响。
用酶学方法达到部分分离纯化的主要依据是不同组织的细胞和间质的构成不同。
例如，欲从皮肤材料获取上皮细胞，就可以利用皮肤的表皮与表皮下的结缔组织二者之间细胞间质成分的差异，以胰蛋白酶进行消化，这样就会得到大量分散的上皮细胞，而混杂的结缔组织细胞成分很少，若用胶原酶来消化则得到的细胞悬液中主要为成纤维细胞。
、化学解离
常用EDTA消法：化EDTA是一种非酶消化物，能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织尤其是上皮组织分散效果好。
喻主任特别介绍了不同组织材料的酶分离推荐（表2、）以及制备单细胞悬液的注意事项和建议（表4）如下：
表2实体组织解离的消化酶种类
表分离不同组织时常用的胶原酶种类
表4制备单细胞悬液的注意事项和建议
喻主任还分享了团队实验室所采用的组织分离方法——机械解离法的具体步骤（图1）：
1、组织放入到组织培养皿中，机械法手动把组织分散为单细胞悬液；
2、细胞悬液通过过滤器以除去细胞团和细胞碎片；
、收集到离心管中的细胞悬液离心，洗涤1-2次；
4、重悬沉淀细胞，做计数和活力分析；
5、调整细胞浓度；
6、常规流式检测。
图1组织细胞分离方法示意图
最后喻新建主任通过一个病例提醒大家注意，对于经常有骨髓/血累及的恶性肿瘤，常规流式检测同样很有诊断意义，因此不要矫枉过正，只送组织流式。
专家介绍
喻新建
高博诊断中心流式细胞实验室主任、整合诊断专家组专家。
主任医师，北京医科大学医学博士，德国乌尔姆大学博士后。德意志学术交流中心(DAAD)奖学金获得者。
有0多年血液病临床及实验诊断工作及研究经验。曾先后在大连医科大学、医院血研所、德国乌尔姆大学、医院从事血液病临床、实验室诊断与研究。