背景研究目的
BANKGROUND
食道腺癌（EAC）是异质性的，且发生时期早于Barrett食道（BE）。许多基因组的变异与BE和EAC的进展有关，但表观遗传学变异如何目前未知。研究人员对BE和EAC组织进行表观遗传学分析，并将这些数据与转录组和基因组数据结合起来，以鉴定控制基因表达和基因组完整性的机制。
研究方法
METHOD
研究人员收集了英国食道癌分类和分子分级的例BE和例EAC组织样本和临床数据，分析了所有的BE和EAC组织的甲基化谱，并使用非负矩阵分解和k均值聚类将他们分为不同亚组，然后整合全基因组测序和转录组研究的数据，进行甲基化组和RNA-seq分析，以鉴定在启动子区域甲基化增加而被抑制的基因。使用大样本基因集富集方法计算了不同免疫细胞类型水平，从8个EAC组织衍生出8个类器官，并测试了它们对不同药物的敏感性。
结果分析
RESLUT
本研究使用IlluminaMethylationEPICBeadChip全面捕获全基因组甲基化变化；使用分析个EAC和个BE病例以及个对照（包括对照鳞状食道39例，胃贲门38例，十二指肠23例，作为肠道分化比较）。
01
BE和EAC的甲基化谱揭示了四个具有独立复制的亚型
对所有样本中选择的种变化最大的探针进行了主成分分析，发现BE和EAC表型一致，且类似于胃贲门和十二指肠，但与正常的鳞状食管不同；进一步利用NMF聚类鉴定到四个基因集。对这四个基因集的表达量进一步做k-means聚类，得到四个亚型。图1A表示每个亚型具有独特的甲基化模式，BE样本分布在4个亚型中，BE样本在亚型2，3，1中的比例分别是83.2%，33.3%，13.6%。将探针分为A,B,C三个区块，在区块A中，大多数探针与CpGi重叠且位于启动子区域，而大多数探针在B和C区块中属于基因body和基因间区。与对照组和其他亚组相比，亚型1和2中的A嵌段探针通常会获得甲基化优势。B区的探针在亚型4中是低甲基化，而C区的探针在亚型2中未甲基化。对于EAC，除了分化状态外，没有发现亚型与临床信息（例如肿瘤位置，化疗状态，分化状态）之间有任何显著关联。
图1：基于甲基化的BE/EAC亚型
02
与DNA突变有关的甲基化谱
整合全基因组测序数据，观察到亚型1和4与亚型2和亚型3相比具有更高的突变负荷。TP53和CDKN2A是整个队列中两个高频变异的基因，其中TP53在亚型1（78％）和亚型4（78％）中更易突变，而在亚型2和亚型3中，TP53和CDKN2A变异率分别是37％和46％。CDKN2A在亚型2中更易发生删除变异，这与BE的高患病率（67％，p值0.）相一致。ERBB2在亚型1（19％）和亚型4（29％）中都发生扩增变异。一些遗传事件似乎是亚型特异性的，如GATA4（22％），CCND1（21％），KCNQ3（19％），MYC（23％），CDK6（17％）和KRAS（18％）在亚型1中更易变异，而CCNE1（21％）和APC（12％）更易在亚型4中发生改变。将这些突变基因富集到功能途径，亚型1和4突变基因富集在受体酪氨酸激酶（RTK）和细胞周期发生途径。亚型1中除CCNE1以外的所有细胞周期关键驱动因子都变异了，而亚型4中Wnt途径（APC）异常，MDM2在亚型3中优先扩增（8％）。
03
对每个亚组的甲基化，基因组和表达特征进行综合分析
亚型1：将亚型1与对照对比，发现高甲基化和低甲基化探针的比例相似。但低甲基化分布在整个基因组中，而高甲基化则在局部区域中表现明显，主要是富含CpGi的启动子（图2A）。进一步观察到66%的高甲基化探针和1％的低甲基化探针与CpG岛重叠，大多数（59％）发生在启动子区域，表现CIMP样表型（图2B）。比较了来自ENCODE34、35和ROADMAP表观基因组学联盟的鳞状，胃和十二指肠组织中的抑制性Hme3和激活标记与H3K27ac的数据。在所有组织中，有77％的高甲基化区域标记为H3K27me3，23％的区域标记为H3K27ac（图2C）。与所有其他亚型相比，亚型1的基于转录组的途径分析显示了与DNA修复和细胞周期有关的途径的丰富（图2D）。
图2：高甲基化驱动的亚型1
亚型2：亚型2以BE病例中CpGi高甲基化为主。研究人员评估是否在EAC中也看到了该亚型的高甲基化变化，进一步比较亚型1和2中差异化的高甲基化探针。这表明大多数（85％）的高甲基化探针在这些亚型之间共有。EAC表明高甲基化是一个早期事件（图3A，B）。即使观察到BE和EAC之间的高甲基化模式存在强烈相似性，也存在着一个未甲基化的C区探针（图3A）。这些可能是在BE中保持组织特异性的独特区域，因此其水平与胃相似但与鳞状或十二指肠表型不相上下（图3C）。为了预测不同转录因子的作用模式，利用远端探针的优势，并观察到在特定于亚型2的远端调节区域的探针中，包括HNF4A/G，FOXA1/2/3，GATA6和CDX2在内的关键转录因子基序显著过表达（图3D）。
图3：BE特异的亚型2
亚型3：与其他亚型相比，亚型3中未观察到甲基化的强烈变化。但从RNA-seq数据中，观察到亚型3在先天和适应性免疫细胞（*性细胞、B细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞以及与癌症相关的成纤维细胞（CAF）具有很强的富集性，另外还观察到该亚型的T辅助细胞表达水平降低，而亚型2中没有显示出对免疫浸润的富集（图4A）。另发现亚型3在免疫调节相关的所有途径都得到了富集（4B）。使用GZMB作为*性细胞的标志物，通过IHC染色验证了来自不同亚型的多种情况下的丰度并与其他亚型相比，亚型3中GZMB的相对丰度显著高（图4C）。从全基因组测序数据计算得出，亚型3中高水平的免疫浸润还表明肿瘤含量成比例降低。
图4：免疫调节亚型3
亚型4：亚型4主要由低甲基化控制（图5A），BE和EAC在内的许多癌症类型的早期和晚期都观察到广泛的低甲基化，导致基因的表达上调。与其他亚型相比，亚型4表现较高的拷贝数变化，其分布在整个基因组中（图5B）。亚型4还具有更多的类似ERBB2的染色体变异，其特征是该基因的拷贝数超过10，而在亚型1中，大多数是低水平扩增（图5C）。经过多次验证，亚型4甲基化水平低的患者携带高水平的SV（图5D），这与甲基化水平对维持基因组稳定性发挥关键作用观点一致。根据甲基化谱，亚组之间的总生存率存在差异（图5E）。亚型2中与BE病例成簇的少数EAC病例存活率最高，与其他亚型的患者相比，具有免疫激活表型、较低的突变负荷和较少的致癌驱动子的亚型3具有较差的存活率。
图5：低甲基化驱动的亚型4
04
表观遗传沉默的基因及其与治疗的相关性
为了探究哪些基因与甲基化变异相关的转录抑制相关，整合甲基化组和转录组进行分析。在个与甲基化增加有关的表达显着较低的基因中，几乎没有基因在所有亚型中都受到全局影响，大多数沉默基因对亚型1和2更具特异性（图6A）。有研究表明，DNA修复中的关键调控因子MGMT基因在近50％的胶质母细胞瘤病例中发生甲基化，与非甲基化MGMT启动子的患者相比，这些患者从替莫唑胺化疗中获益更大。在此队列中，MGMT受启动子区域甲基化的调节并影响32％的病例（图6B）。为了检查EAC中对替莫唑胺的反应，利用该队列中类器官观察到对替莫唑胺高度敏感，在CAM等RNA和蛋白质水平上均显示MGMT低表达。在CAM中，具有稳定MGMT表达的类器官表现出抗性（图6D，E）。在队列中，观察到在18％的病例中CHFR发生变异，其中大多数更易受到亚型1和类器官模型的影响，CHFR的表达水平与对多西紫杉醇的差异反应相关。在较小比例的病例中，预计将有50％以上的EAC（n=）受益于CDK4/6抑制剂以及EZH2和BET抑制剂。另还观察到CDK4/6抑制剂对所有亚型的EAC有效。观察到CDK2（p值0.）抑制剂在亚型4中更有效（图6F）。这种选择性反应是由于亚型4中CCNE1的优先扩增所致。
图6：表观遗传沉默的基因和临床意义
结果总结
SUMMARY
与来自相同患者的正常组织（食管，胃和十二指肠；对照组）相比，BE和EAC样品具有全基因组甲基化特征，并分为4个亚型。亚型1的特征是DNA高甲基化，具有高突变负担，并且在细胞周期和受体酪氨酸信号通路中存在多个基因突变；亚型2的特征是与代谢过程相关的基因表达模式（ATP合成和脂肪酸氧化）且缺乏甲基化在转录因子的特定结合位点；该亚型的样本中83％为BE，EAC为17％。与对照组织相比，第3亚型的甲基化模式没有变化，但是具有指示免疫细胞浸润的基因表达模式。这种肿瘤类型与患者生存时间最短有关。第4个亚型的特征是与结构重排，拷贝数改变和CCNE1优先扩增相关的DNA甲基化不足（据报道，具有该基因扩增的细胞对CDK2抑制剂敏感）。MGMT和CHFR表达水平降低的类器官对替莫唑胺和紫杉烷类药物敏感。
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